Hace 15 años
viernes, 15 de agosto de 2008
Dia 9
Hoy extrajimos vectores con ADN inserto de un cultivo de bacterias E.Coli, un procedimiento similar al realizado en el día 6 con la diferencia de que en este caso nuestra intención era obtener una gran cantidad de a vectores y poder calcular su concentración.
Este método de la lisis alcalina también es conocido como Maxiprep, el método del día pasado es conocido como Miniprep, el fundamento es el mismo, por eso solo aclararemos algunos pasos importantes.
El protocolo en forma breve es el siguiente, primero centrifugamos el cultivo a 6000 rpm 15 min, resuspendemos con una solución compuesta de Tris Base y EDTA con 50 ug/ml de RNAasa.
Luego agregamos NaOH y SDS y mezclamos por inversión, al momento siguinte agregamos un buffer, mezclamos por inversión de nuevo e incubamos en hielo 20 min.
Después de esto centrifugamos a 1300 rpm 30 min a 4ºC, conservamos el sobregradante para volver a centrifugarlo pero esta vez 15 minutos para otra vez tener que conservar el sobregradante y desechar el pellet.
Este sobregradante será precipitado con 0.7 vol de isopropanol y centrifugado a 9500 rpm 30 min a 4 ºC para obtener otro sobregradante que esta vez debe ser descartado.
En la etapa final del protocolo se lava con 5 ml de EtOH 70% y se centrifuga a 9500 rpm para luego descartar el sobregradante
Por ultimo se deja secar el pellet de 5-10 min con luz de lampara, acto contiguo se lo resuspende en 500ul de TE ph 8 y se lo lleva al espectrofotómetro para determinar su concentración con la ayuda de una curva preexistente
Este método de la lisis alcalina también es conocido como Maxiprep, el método del día pasado es conocido como Miniprep, el fundamento es el mismo, por eso solo aclararemos algunos pasos importantes.
El protocolo en forma breve es el siguiente, primero centrifugamos el cultivo a 6000 rpm 15 min, resuspendemos con una solución compuesta de Tris Base y EDTA con 50 ug/ml de RNAasa.
Luego agregamos NaOH y SDS y mezclamos por inversión, al momento siguinte agregamos un buffer, mezclamos por inversión de nuevo e incubamos en hielo 20 min.
Después de esto centrifugamos a 1300 rpm 30 min a 4ºC, conservamos el sobregradante para volver a centrifugarlo pero esta vez 15 minutos para otra vez tener que conservar el sobregradante y desechar el pellet.
Este sobregradante será precipitado con 0.7 vol de isopropanol y centrifugado a 9500 rpm 30 min a 4 ºC para obtener otro sobregradante que esta vez debe ser descartado.
En la etapa final del protocolo se lava con 5 ml de EtOH 70% y se centrifuga a 9500 rpm para luego descartar el sobregradante
Por ultimo se deja secar el pellet de 5-10 min con luz de lampara, acto contiguo se lo resuspende en 500ul de TE ph 8 y se lo lleva al espectrofotómetro para determinar su concentración con la ayuda de una curva preexistente
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