Dia 8

Realizamos un control para determinar si el vector que habiamos purificado era realmente el que esperabamos, MageB2.
Utilizamos el programa nebcutter para analizar las enzimas de restricciòn que corta esa secuencia y observamos que la digestion con HindIII debia dar un patron de bandas determinado: 4500pb, 500pb, 300pb y 200pb.

La digestiòn con HindIII se realizò en un volumen total de 20ul, en el buffer indicado por el catalogo, 1 ul de enzima HindIII y 1microgramo de vector. Luego de 1 hora a 37 grados consideramos finalizada la reacciòn de digestiòn.

Luego de la digestiòn con esta enzima realizamos una corrida electroforètica en geles de agarosa y obtuvimos el patròn de bandas esperado mediante la estimaciòn de la dimesion de las bandas por comparacion con pesos moleculares estàndard.

Dia 7

Hoy hicimos purificaciones de vectores a partir de cultivo de bacterias.
Las bacterias E.Coli se utilizan en el laboratorio para amplificar en cantidad de los vectores que luego seran utilizados en distintos experimentos.
Pequenas cantidades de ADN de los vectores de interes se introducen en las bacterias por un metodo que se llama "transformacion de bacterias". Una vez incorporado el vector, la bacteria los replica muchas veces. Para su utilizacion en los experimentos, estos vectores deben ser purificados de las bacterias. Este es un procedimiento de rutina en los laboratorios de biologia molecular.
Realizamos los siguientes pasos. Tomamos las bacterias que habian crecido durante toda la noche a 37 grados en medio liquido y las pasamos a tubos pequennos tipo eppendorf. Las centrifugamos y nos quedamos con el fondo de bacterias. Luego agregamos una solucion para resuspenderlas y luego las lisamos con otra solucion que contiene NaOH y un detergente (SDS). Este medio alcalino fue neutralizado con un buffer acètico/acetato de sodio y centrifugamos. Todos los residuos de bacterias fueron al fondo del tubo, mientras que el ADN del vector quedo en solucion. Ese ADN del vector fue purificado por su afinidad por un soporte solido (Resina) como el silicato. Luego eluimos el ADN puro y lo cuantificamos mediante un gel de agarosa.

Dia 6

En el dia de la fecha realizamos una digestion del DNA de MageA6 y MageA4 con la enzima de restricciòn HindIII; luego corrimos en un gel de agarosa para visulizar los productos de la digestion.
El dia 5, mediante la utilizaciòn de un programa de informàtica que detecta los sitios de las enzimas de restricciòn, observamos que MageA6 tenia un sitio para HindIII que no se encontraba completa en MageA4. Las secuencias de ambos genes son muy similares, y observamos que MageA4 tiene una sola base de diferencia en el sitio de corte de HindIII: la secuencia correcta en MageA6 es AAGCTT, mientras que en MageA4 la secuencia es AAGCCT. Quisimos comprobar la especificidad de esta enzima digiriendo vectores que donde estan clonados estos genes. El producto de la digestiòn de MageA4 y MageA6 con HindIII, fue verificado en una electroforesis en gel de agarosa: Si HindIII corta en su sitio, esperamos ver una banda de 600 bases, sino corta se observa el vector correspondiente sin producto de digestiòn.En la figura de abajo se muestra la comparaciòn entre ambas secuencias mediante la alineaciòn de MageA6 (abajo) y MageA4. Se senala la diferencias en el sitio de corte HindIII