Dia 5

Hoy aprendimos la utilizaciòn de las herraminetas informàticas para encontrar, comparar y estudiar secuencias de ADN o proteìnas.
Buscamos secuencias de los genes de nuestro interès utilizando el sitio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ que es un banco de datos muy utilizado, done se pueden obtener las secuencias de genes. Nosotros obtuvimos las secuencias de MageA4 y MageA6.
Ambas secuencias fueron comparadas (alineadas) utilizando un programa llamado BLAST 2 seq. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/bl2seq/wblast2.cgi
A continuaciòn se buscò las enzimas de restricciòn que podìan cortar en ambos genes utilizando el programa Neb cutter http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php

Este programa realizò el mapa de restricciòn de MageA4 y MageA6 y observamos que a pesar de ser dos genes muy similares, habìa una diferencia en el sitio de corte de la enzima HindIII. Observamos que MageA4 tiene una sola base de diferencia en el sitio de corte de HindIII: la secuencia correcta en MageA6 es AAGCTT, mientras que en MageA4 la secuencia es AAGCCT.

Esta diferencia hace que HindIII corte MageA6 pero no MageA4. Este control se realizò el dia 6.

Dia 4

Concurrí yo solo porque Leonel estaba ganando el modelo iberoamericano de naciones unidas (felicitaciones campeon). En este día profundizamos mas lo que habiamos visto en el dia 3.

Este dìa se mostrò como se revela el westen blot.

La membrana con la transferencia realizada el dia 3, fue cortada en dos e incubada con un anticuerpo primario que reconoce la proteìna MAGE (abajo) y un anticuerpo primario que reconoce la proteìna ACTINA.

El anticuerpo secundario utilizado estaba conjugado a la peroxidasa HRPO. La reacciòn de luminiscencia se llevò a cabo mediante la incubaciòn de las membranas con los sustratos de la peroxidasa: H2O2 y Luminol, dos minutos antes de revelar. La peroxidasa con el H2O2 oxida el luminol, que emite luz. La intensidad de esta luz fue medida en un luminòmetro adaptado a la lectura de membranas de western blot.

La figura muestra la imagen obtenida por este metodo. La ACTINA tiene una intensidad constante en todas las calles, mientras que MAGE varia en intensidad entre las distintas muestras.

Dia 3

Este dìa se focalizò sobre la utilizaciòn de anticuerpos para detectar proteìnas. Esta explicaciòn se debe a que luego de expresar las proteìnas mediante la transfecciòn de vectores, es necesario poder detectralas ya sea en ensayos de western blot o inmunofluorescencia.
En general, la detecciòn de una proteìna se realiza mediante la utilizaciòn de un anticuerpo especìfico que reconoce a esa proteìna con alta afinidad. Este anticuerpo se llama anticuerpo primario. Una vez unido a la proteìna especìfica, el anticuerpo primario es reconocido por un anticuerpo secundario, que està conjugado a alguna senal detectable. En el caso del western blot, el anticuerpo secundario esta unido a una enzima peroxidasa que es detectada por una reacciòn de quimioluminiscencia. En el caso del la inmunofluorescencia, el anticuerpo secundario esta unido a una molecula fluorescente que permite visualizarlo en el microscopio de fluorescencia.

En este caso, se siguiò el procedimiento para realizar un westen blot. Se observò el armado de las cubas de electroforesis para geles de poliacrilamida, el cargado de la muestra, la corrida y la transferencia de las proteìnas corridas a membrana de nitrocelulosa.