Hace 15 años
viernes, 15 de agosto de 2008
Dia 9
Hoy extrajimos vectores con ADN inserto de un cultivo de bacterias E.Coli, un procedimiento similar al realizado en el día 6 con la diferencia de que en este caso nuestra intención era obtener una gran cantidad de a vectores y poder calcular su concentración.
Este método de la lisis alcalina también es conocido como Maxiprep, el método del día pasado es conocido como Miniprep, el fundamento es el mismo, por eso solo aclararemos algunos pasos importantes.
El protocolo en forma breve es el siguiente, primero centrifugamos el cultivo a 6000 rpm 15 min, resuspendemos con una solución compuesta de Tris Base y EDTA con 50 ug/ml de RNAasa.
Luego agregamos NaOH y SDS y mezclamos por inversión, al momento siguinte agregamos un buffer, mezclamos por inversión de nuevo e incubamos en hielo 20 min.
Después de esto centrifugamos a 1300 rpm 30 min a 4ºC, conservamos el sobregradante para volver a centrifugarlo pero esta vez 15 minutos para otra vez tener que conservar el sobregradante y desechar el pellet.
Este sobregradante será precipitado con 0.7 vol de isopropanol y centrifugado a 9500 rpm 30 min a 4 ºC para obtener otro sobregradante que esta vez debe ser descartado.
En la etapa final del protocolo se lava con 5 ml de EtOH 70% y se centrifuga a 9500 rpm para luego descartar el sobregradante
Por ultimo se deja secar el pellet de 5-10 min con luz de lampara, acto contiguo se lo resuspende en 500ul de TE ph 8 y se lo lleva al espectrofotómetro para determinar su concentración con la ayuda de una curva preexistente
Este método de la lisis alcalina también es conocido como Maxiprep, el método del día pasado es conocido como Miniprep, el fundamento es el mismo, por eso solo aclararemos algunos pasos importantes.
El protocolo en forma breve es el siguiente, primero centrifugamos el cultivo a 6000 rpm 15 min, resuspendemos con una solución compuesta de Tris Base y EDTA con 50 ug/ml de RNAasa.
Luego agregamos NaOH y SDS y mezclamos por inversión, al momento siguinte agregamos un buffer, mezclamos por inversión de nuevo e incubamos en hielo 20 min.
Después de esto centrifugamos a 1300 rpm 30 min a 4ºC, conservamos el sobregradante para volver a centrifugarlo pero esta vez 15 minutos para otra vez tener que conservar el sobregradante y desechar el pellet.
Este sobregradante será precipitado con 0.7 vol de isopropanol y centrifugado a 9500 rpm 30 min a 4 ºC para obtener otro sobregradante que esta vez debe ser descartado.
En la etapa final del protocolo se lava con 5 ml de EtOH 70% y se centrifuga a 9500 rpm para luego descartar el sobregradante
Por ultimo se deja secar el pellet de 5-10 min con luz de lampara, acto contiguo se lo resuspende en 500ul de TE ph 8 y se lo lleva al espectrofotómetro para determinar su concentración con la ayuda de una curva preexistente
jueves, 17 de julio de 2008
Dia 8
Realizamos un control para determinar si el vector que habiamos purificado era realmente el que esperabamos, MageB2.
Utilizamos el programa nebcutter para analizar las enzimas de restricciòn que corta esa secuencia y observamos que la digestion con HindIII debia dar un patron de bandas determinado: 4500pb, 500pb, 300pb y 200pb.
La digestiòn con HindIII se realizò en un volumen total de 20ul, en el buffer indicado por el catalogo, 1 ul de enzima HindIII y 1microgramo de vector. Luego de 1 hora a 37 grados consideramos finalizada la reacciòn de digestiòn.
Luego de la digestiòn con esta enzima realizamos una corrida electroforètica en geles de agarosa y obtuvimos el patròn de bandas esperado mediante la estimaciòn de la dimesion de las bandas por comparacion con pesos moleculares estàndard.
Utilizamos el programa nebcutter para analizar las enzimas de restricciòn que corta esa secuencia y observamos que la digestion con HindIII debia dar un patron de bandas determinado: 4500pb, 500pb, 300pb y 200pb.
La digestiòn con HindIII se realizò en un volumen total de 20ul, en el buffer indicado por el catalogo, 1 ul de enzima HindIII y 1microgramo de vector. Luego de 1 hora a 37 grados consideramos finalizada la reacciòn de digestiòn.
Luego de la digestiòn con esta enzima realizamos una corrida electroforètica en geles de agarosa y obtuvimos el patròn de bandas esperado mediante la estimaciòn de la dimesion de las bandas por comparacion con pesos moleculares estàndard.
Dia 7
Hoy hicimos purificaciones de vectores a partir de cultivo de bacterias.
Las bacterias E.Coli se utilizan en el laboratorio para amplificar en cantidad de los vectores que luego seran utilizados en distintos experimentos.
Pequenas cantidades de ADN de los vectores de interes se introducen en las bacterias por un metodo que se llama "transformacion de bacterias". Una vez incorporado el vector, la bacteria los replica muchas veces. Para su utilizacion en los experimentos, estos vectores deben ser purificados de las bacterias. Este es un procedimiento de rutina en los laboratorios de biologia molecular.
Realizamos los siguientes pasos. Tomamos las bacterias que habian crecido durante toda la noche a 37 grados en medio liquido y las pasamos a tubos pequennos tipo eppendorf. Las centrifugamos y nos quedamos con el fondo de bacterias. Luego agregamos una solucion para resuspenderlas y luego las lisamos con otra solucion que contiene NaOH y un detergente (SDS). Este medio alcalino fue neutralizado con un buffer acètico/acetato de sodio y centrifugamos. Todos los residuos de bacterias fueron al fondo del tubo, mientras que el ADN del vector quedo en solucion. Ese ADN del vector fue purificado por su afinidad por un soporte solido (Resina) como el silicato. Luego eluimos el ADN puro y lo cuantificamos mediante un gel de agarosa.
Las bacterias E.Coli se utilizan en el laboratorio para amplificar en cantidad de los vectores que luego seran utilizados en distintos experimentos.
Pequenas cantidades de ADN de los vectores de interes se introducen en las bacterias por un metodo que se llama "transformacion de bacterias". Una vez incorporado el vector, la bacteria los replica muchas veces. Para su utilizacion en los experimentos, estos vectores deben ser purificados de las bacterias. Este es un procedimiento de rutina en los laboratorios de biologia molecular.
Realizamos los siguientes pasos. Tomamos las bacterias que habian crecido durante toda la noche a 37 grados en medio liquido y las pasamos a tubos pequennos tipo eppendorf. Las centrifugamos y nos quedamos con el fondo de bacterias. Luego agregamos una solucion para resuspenderlas y luego las lisamos con otra solucion que contiene NaOH y un detergente (SDS). Este medio alcalino fue neutralizado con un buffer acètico/acetato de sodio y centrifugamos. Todos los residuos de bacterias fueron al fondo del tubo, mientras que el ADN del vector quedo en solucion. Ese ADN del vector fue purificado por su afinidad por un soporte solido (Resina) como el silicato. Luego eluimos el ADN puro y lo cuantificamos mediante un gel de agarosa.
Dia 6
En el dia de la fecha realizamos una digestion del DNA de MageA6 y MageA4 con la enzima de restricciòn HindIII; luego corrimos en un gel de agarosa para visulizar los productos de la digestion.
El dia 5, mediante la utilizaciòn de un programa de informàtica que detecta los sitios de las enzimas de restricciòn, observamos que MageA6 tenia un sitio para HindIII que no se encontraba completa en MageA4. Las secuencias de ambos genes son muy similares, y observamos que MageA4 tiene una sola base de diferencia en el sitio de corte de HindIII: la secuencia correcta en MageA6 es AAGCTT, mientras que en MageA4 la secuencia es AAGCCT. Quisimos comprobar la especificidad de esta enzima digiriendo vectores que donde estan clonados estos genes. El producto de la digestiòn de MageA4 y MageA6 con HindIII, fue verificado en una electroforesis en gel de agarosa: Si HindIII corta en su sitio, esperamos ver una banda de 600 bases, sino corta se observa el vector correspondiente sin producto de digestiòn.En la figura de abajo se muestra la comparaciòn entre ambas secuencias mediante la alineaciòn de MageA6 (abajo) y MageA4. Se senala la diferencias en el sitio de corte HindIII
El dia 5, mediante la utilizaciòn de un programa de informàtica que detecta los sitios de las enzimas de restricciòn, observamos que MageA6 tenia un sitio para HindIII que no se encontraba completa en MageA4. Las secuencias de ambos genes son muy similares, y observamos que MageA4 tiene una sola base de diferencia en el sitio de corte de HindIII: la secuencia correcta en MageA6 es AAGCTT, mientras que en MageA4 la secuencia es AAGCCT. Quisimos comprobar la especificidad de esta enzima digiriendo vectores que donde estan clonados estos genes. El producto de la digestiòn de MageA4 y MageA6 con HindIII, fue verificado en una electroforesis en gel de agarosa: Si HindIII corta en su sitio, esperamos ver una banda de 600 bases, sino corta se observa el vector correspondiente sin producto de digestiòn.En la figura de abajo se muestra la comparaciòn entre ambas secuencias mediante la alineaciòn de MageA6 (abajo) y MageA4. Se senala la diferencias en el sitio de corte HindIII
jueves, 19 de junio de 2008
Dia 5
Hoy aprendimos la utilizaciòn de las herraminetas informàticas para encontrar, comparar y estudiar secuencias de ADN o proteìnas.
Buscamos secuencias de los genes de nuestro interès utilizando el sitio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ que es un banco de datos muy utilizado, done se pueden obtener las secuencias de genes. Nosotros obtuvimos las secuencias de MageA4 y MageA6.
Ambas secuencias fueron comparadas (alineadas) utilizando un programa llamado BLAST 2 seq. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/bl2seq/wblast2.cgi
A continuaciòn se buscò las enzimas de restricciòn que podìan cortar en ambos genes utilizando el programa Neb cutter http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php
Este programa realizò el mapa de restricciòn de MageA4 y MageA6 y observamos que a pesar de ser dos genes muy similares, habìa una diferencia en el sitio de corte de la enzima HindIII. Observamos que MageA4 tiene una sola base de diferencia en el sitio de corte de HindIII: la secuencia correcta en MageA6 es AAGCTT, mientras que en MageA4 la secuencia es AAGCCT.
Esta diferencia hace que HindIII corte MageA6 pero no MageA4. Este control se realizò el dia 6.
Buscamos secuencias de los genes de nuestro interès utilizando el sitio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ que es un banco de datos muy utilizado, done se pueden obtener las secuencias de genes. Nosotros obtuvimos las secuencias de MageA4 y MageA6.
Ambas secuencias fueron comparadas (alineadas) utilizando un programa llamado BLAST 2 seq. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/bl2seq/wblast2.cgi
A continuaciòn se buscò las enzimas de restricciòn que podìan cortar en ambos genes utilizando el programa Neb cutter http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php
Este programa realizò el mapa de restricciòn de MageA4 y MageA6 y observamos que a pesar de ser dos genes muy similares, habìa una diferencia en el sitio de corte de la enzima HindIII. Observamos que MageA4 tiene una sola base de diferencia en el sitio de corte de HindIII: la secuencia correcta en MageA6 es AAGCTT, mientras que en MageA4 la secuencia es AAGCCT.
Esta diferencia hace que HindIII corte MageA6 pero no MageA4. Este control se realizò el dia 6.
miércoles, 11 de junio de 2008
Dia 4
Concurrí yo solo porque Leonel estaba ganando el modelo iberoamericano de naciones unidas (felicitaciones campeon). En este día profundizamos mas lo que habiamos visto en el dia 3.
Este dìa se mostrò como se revela el westen blot.
La membrana con la transferencia realizada el dia 3, fue cortada en dos e incubada con un anticuerpo primario que reconoce la proteìna MAGE (abajo) y un anticuerpo primario que reconoce la proteìna ACTINA.
El anticuerpo secundario utilizado estaba conjugado a la peroxidasa HRPO. La reacciòn de luminiscencia se llevò a cabo mediante la incubaciòn de las membranas con los sustratos de la peroxidasa: H2O2 y Luminol, dos minutos antes de revelar. La peroxidasa con el H2O2 oxida el luminol, que emite luz. La intensidad de esta luz fue medida en un luminòmetro adaptado a la lectura de membranas de western blot.
La figura muestra la imagen obtenida por este metodo. La ACTINA tiene una intensidad constante en todas las calles, mientras que MAGE varia en intensidad entre las distintas muestras.
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